Introduction à la cytométrie en flux

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La cytométrie en flux est une technologie laser populaire utilisée pour analyser les caractéristiques des cellules ou des particules. Découvrez-en plus avec notre introduction à la cytométrie en flux. 

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La cytométrie en flux est une méthode largement utilisée pour analyser l’expression de molécules de surface et intracellulaires, caractériser et définir différents types de cellules dans une population hétérogène, évaluer la pureté de sous-populations isolées et analyser la taille et le volume des cellules. Il permet une analyse multiparamétrique simultanée de cellules individuelles.

Il est principalement utilisé pour mesurer l’intensité de fluorescence produite par des anticorps détectant des protéines marquées par une fluorescence, ou des ligands qui se lient à des molécules spécifiques associées aux cellules telles que la liaison de l’iodure de propidium à l’ADN.

La procédure de coloration consiste à préparer une suspension monocellulaire à partir d’échantillons de culture cellulaire ou de tissu. Les cellules sont ensuite incubées dans des tubes ou des plaques de microtitration avec des anticorps non marqués ou marqués au fluorochrome et analysées sur le cytomètre en flux.

Le cytomètre en flux: la fluidique

Fluide cytomètre en flux

Figure 1. Vue d’ensemble du cytomètre en flux. Le fluide de gaine concentre la suspension cellulaire, amenant les cellules à traverser un faisceau laser, cellule par cellule. La lumière avant et latérale dispersée est détectée, ainsi que la fluorescence émise par les cellules colorées.

Lorsqu’une suspension de cellules traverse le cytomètre, le fluide de gaine est utilisé pour concentrer de manière hydrodynamique la suspension de cellules à travers une petite buse. Le minuscule flux de fluide emmène les cellules devant la lumière laser une cellule à la fois (Figure 1).

La lumière diffusée par les cellules ou les particules est détectée lors de leur passage dans le faisceau laser. Un détecteur situé devant le faisceau lumineux mesure la diffusion vers l’avant (FS) et plusieurs détecteurs sur le côté mesurent la diffusion latérale (SS). Les détecteurs de fluorescence mesurent la fluorescence émise par les cellules ou les particules colorées positivement.

Le cytomètre en flux: mesure de la dispersion de la lumière dans les deux sens

Les cellules ou les particules traversant le faisceau diffusent de la lumière, qui est détectée comme étant FS et SS. La FS est en corrélation avec la taille de la cellule et le SS est proportionnel à la granularité des cellules. De cette manière, les populations de cellules peuvent souvent être distinguées sur la base de différences de taille et de granularité uniquement.

Diffusion de la lumière par cytométrie en flux

Figure 2. Diffusion de la lumière lorsque le laser vert interroge la cellule. La direction de la lumière diffusée par la cellule est en corrélation avec la taille et la granularité de la cellule.

Un exemple utile de ceci est le prélèvement d’échantillons de sang sur le cytomètre en flux.

  • Les cellules granulocytaires plus grosses et plus granulaires produisent une population nombreuse avec des taux élevés de SS et de FS.
  • Les monocytes sont de grosses cellules, mais pas aussi granulaires, elles produisent donc une population séparée avec une FS élevée mais une SS plus faible.
  • Les plus petits lymphocytes et lymphoblastes produisent une population séparée avec moins de FS. Ce ne sont pas des cellules granulaires, donc ont également un faible SS.

Par conséquent, ces cellules peuvent être séparées en différentes populations en fonction de leurs FS et SS uniquement.

Diagramme de points de cytométrie en flux de FS vs SS

Figure 3. Diagramme à points de FS par rapport à SS. Chaque point représente une seule cellule analysée par le cytomètre en flux. La position caractéristique des différentes populations de cellules est déterminée par les différences de taille et de granularité des cellules. Référence d’image: Riley et Idowu. Principes et applications de la cytométrie en flux * .

Le cytomètre en flux: mesure de la lumière diffusée et de la fluorescence

En plus de séparer les cellules basées sur FS et SS, les cellules peuvent également être séparées en exprimant si elles expriment une protéine particulière. Dans ce cas, un fluorochrome est souvent utilisé pour colorer la protéine d’intérêt. Les fluorochromes utilisés pour la détection des protéines cibles émettent de la lumière lorsqu’ils sont excités par un laser de longueur d’onde d’excitation correspondante. Ces cellules ou particules colorées fluorescentes peuvent être détectées individuellement.

La lumière dispersée vers l’avant et sur les côtés et la fluorescence des cellules colorées sont divisées en longueurs d’onde définies et canalisées par un ensemble de filtres et de miroirs à l’intérieur du cytomètre de flux. La lumière fluorescente est filtrée afin que chaque capteur détecte la fluorescence uniquement à une longueur d’onde spécifiée. Ces capteurs sont appelés tubes photomultiplicateurs (PMT).

Cytométrie en flux |  Lumière fluorescente filtrée

Figure 4. La lumière fluorescente est filtrée afin que chaque PMT détecte une longueur d’onde spécifique. Les PMT convertissent l’énergie d’un photon en un signal électronique – une tension.

Dans l’exemple présenté à la figure 4, le canal PMT du canal FITC (isothiocyanate de fluorescéine) détectera la lumière émise par le FITC à une longueur d’onde d’environ 519 nm. Le PMT du canal PE détectera la lumière émise par la PE (phycoérythrine) à une longueur d’onde de 575 nm. Chaque PMT détectera également tout autre fluorochrome émettant à une longueur d’onde similaire à celle du fluorochrome qu’il détecte.

Différents filtres sont utilisés dans le cytomètre en flux pour diriger les photons de la longueur d’onde correcte vers chaque PMT (Figure 5).

Filtres dans le cytomètre en flux

Figure 5. Filtres dans le cytomètre en flux. Les filtres passe-bande (BP) permettent la transmission de photons dont les longueurs d’onde se situent dans une plage étroite. Les filtres passe-bas (SP) permettent la transmission de photons en dessous d’une longueur d’onde spécifiée.

Les filtres passe-haut (LP) permettent la transmission de photons au-dessus d’une longueur d’onde spécifiée. Les filtres / miroirs dichroïques (tels que les miroirs LP dichroïques) sont positionnés à un angle de 45 ° par rapport au faisceau lumineux.

Dans un filtre dichroïque à longue passe, les photons situés au-dessus d’une longueur d’onde spécifique sont transmis directement, tandis que les photons situés au-dessous de la longueur d’onde spécifique sont réfléchis à un angle de 90 °.

Mesure du signal

Lorsque la cellule fluorescente traverse le faisceau laser, elle crée un pic ou une impulsion d’émission de photons au fil du temps. Celles-ci sont détectées par le PMT et converties en une impulsion de tension, appelée événement. La hauteur et la surface totales des impulsions sont mesurées par le cytomètre de flux. La surface d’impulsion de tension mesurée sera directement corrélée à l’intensité de la fluorescence pour cet événement.

Mesure de PMT par cytométrie en flux

Figure 6. Le PMT mesure la surface d’impulsion de la tension créée chaque fois qu’une cellule fluorescente libère des photons. Lorsqu’aucune cellule fluorescente ne traverse l’optique, aucun photon n’est émis et aucun signal n’est détecté. Lorsque la cellule marquée fluorescente traverse l’optique et est interrogée par le laser, des photons sont émis et l’intensité de la tension mesurée augmente. Au fur et à mesure que chaque cellule fluorescente termine son chemin à travers le faisceau laser, cela laisse une impulsion de tension dans le temps.

La surface d’impulsion est calculée en additionnant les valeurs de hauteur pour chaque tranche temporelle de l’impulsion, déterminées par la vitesse du convertisseur analogique-numérique (CAN), qui est de 10 MHz (soit 10 millions par seconde ou 10 par microseconde).

Des canaux sont attribués à ces événements en fonction de l’intensité de l’impulsion (zone d’impulsion). Ce signal peut être amplifié en augmentant la tension passant par le PMT.

Histogramme de cytométrie en flux indiquant le nombre de canaux en fonction du nombre d'événements

Figure 7. Un histogramme à un paramètre représentant le numéro de canal en fonction du nombre d’événements. Les canaux sont généralement visualisés sur une échelle logarithmique sur l’axe des x.

Un numéro de canal est attribué à chaque événement en fonction de l’intensité mesurée. plus la fluorescence est intense, plus le numéro de canal attribué à l’événement est élevé.

Mesures d'intensité de fluorescence

Figure 8. Mesures d’intensité de fluorescence pour un résultat négatif et positif. Le résultat négatif indiqué à gauche n’a pas de coloration et de nombreux événements à faible intensité de fluorescence. Un résultat positif est indiqué à droite, il contient un grand nombre d’événements à une intensité de fluorescence élevée.

Pour un résultat positif, vous recherchez le décalage d’intensité entre les échantillons de contrôle négatif et les échantillons positifs (Figure 9).

Coloration de PBMC humaines sur des monocytes

Figure 9. Coloration par anticorps anti-CCR2 (ab21667) de PBMC humaines déclenchées sur des monocytes. Les données proviennent d’un Abreview anonyme.

Coloration des anticorps

  1. Coloration directe:

    dans la coloration directe par immunofluorescence, les cellules sont incubées avec un anticorps directement conjugué à un fluorochrome (par exemple, le FITC). Cela présente l’avantage de ne nécessiter qu’une seule étape d’incubation d’anticorps et d’éliminer la possibilité d’une liaison non spécifique d’un anticorps secondaire.

    Cette approche est particulièrement utile pour la coloration intracellulaire, où de grands complexes anticorps-fluorochrome, y compris des anticorps secondaires, peuvent être piégés, entraînant une liaison non spécifique, ou ne pas pénétrer dans la cellule, empêchant ainsi la détection des anticorps primaires.

  2. Coloration indirecte:

    dans la coloration indirecte, l’anticorps primaire n’est pas marqué au fluorochrome, mais est détecté par un anticorps secondaire marqué au fluorochrome. Ce second réactif peut être un anticorps présentant une spécificité pour le premier anticorps. En variante, le système avidine-biotine peut être utilisé, moyennant quoi un anticorps est conjugué à la biotine et détecté avec de l’avidine marquée au fluorochrome.

    Avec la large gamme d’anticorps conjugués maintenant disponibles, cette méthode signifie que des anticorps primaires non conjugués dirigés contre de nombreuses cibles différentes peuvent être utilisés conjointement avec un anticorps secondaire marqué pour l’analyse FACS. Cela élargit le choix des protéines cibles pour le chercheur.

  3. Coloration intracellulaire:

    La coloration des antigènes intracellulaires pour les protocoles de cytométrie en flux dépend de diverses méthodes de fixation et de perméabilisation afin de permettre l’accès des anticorps aux protéines cellulaires internes. Dans tous les cas, une procédure de coloration réussie dépend de l’optimisation des conditions expérimentales via le titrage des anticorps, l’utilisation de contrôles appropriés pour configurer correctement le cytomètre en flux et l’optimisation des procédures de fixation et de perméabilisation.

  4. Détection des protéines sécrétées:

    La détection des protéines sécrétées est difficile car la protéine sera libérée de la cellule avant la détection ou peut se dégrader rapidement. Un bloc de Golgi tel que la brefeldine A peut être utilisé pour inhiber la sécrétion de protéines exprimées, en les conservant dans l’appareil de Golgi. Le procédé de coloration intracellulaire peut ensuite être utilisé pour la détection de la protéine cible.

Sélection d’un conjugué fluorochrome

La capacité d’un anticorps donné à résoudre un signal positif à partir d’un signal négatif dépend souvent du conjugué de fluorochrome utilisé.

Une ligne directrice générale pour les intensités relatives des divers fluorochromes est la plus brillante à la plus faible, PE, PE-Cy 7, PE-Cy5, APC, APC-Cy7, Alexa Fluor 647®, Alexa Fluor 700®, FITC, Pacific Blue, Alexa Fluor 488®. C’est un schéma général. des différences d’intensités relatives sont observées pour des anticorps individuels.

Un antigène hautement exprimé sera généralement détecté et résolu par le contrôle négatif avec presque tous les fluorochromes. Un antigène exprimé à une densité plus faible pourrait nécessiter le rapport signal sur fond plus élevé fourni par un conjugué de PE ou APC plus brillant pour séparer les cellules positives de manière adéquate des cellules non colorées.

L’intensité relative du fluorochrome dépend de l’instrument. Cela est dû aux différences entre les combinaisons de laser et de filtre utilisées sur les différents instruments. Veillez à utiliser l’instrument FACS approprié.